Nghiên cứu tác dụng điều chỉnh rối loạn chuyển hóa lipid máu trên mô hình ngoại sinh của cao lỏng HSN

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ĐIỀU CHỈNH RỐI LOẠN CHUYỂN HÓA

 LIPID MÁU TRÊN MÔ HÌNH NGOẠI SINH CỦA CAO LỎNG HSN

TrầnThịHồng Ngãi¹, PhạmThịVân Anh²

ABSTRACT

A study on the effect of dyslipidemia adjustment of HSN fluid based on the exogenous mechanism

Objective: The study aims at evaluating the effect of dyslipidemia adjustment of HSN through the exogenous mechanism and evaluate the impact of fluid HSNon the enzyme activity (AST and ALT) in rat blood.Research Methods: Using the mixture cholesterol oil 1mg/100g causes dyslipidemia in the white mice Wistar, weight 200 ± 20g. The mice are divided into 5 groups, 10 mice in each group. Weigh all the mice in each group before and after experiment each week, on the first day – the 15^th (after 2 weeks) and on the 29^th (after 4 weeks) of the experiment, the mice in each group must fast overnight. The results and conclusions: Based on the experimental group causing the increase of exogenous lipid metabolism in white mice, the results showed that: In the HSN dose which was equivalent to the clinical one, there was a significant reduction of triglycerid concentration compared to the control group at a statistically significant difference (p<0,01). There was no change of the TC and LDL-C concentration (p>0,05). In the HSN dose with three times as high as the clinical one, there was a signigicant reduction of triglycerid reduction and a considerable increase of HDL-C concentration compared to the control group (p<0,05). There was no change of the TC and LDL-C concentration (p>0,05). The liver enzyme activities (AST and ALT) in the blood of the mice have not increased with both of these HSN doses after four weeks of treatment.

Keywords: Dyslipidemia, HSN remedy, the pharmacological effect on experiment, exogenous mechanism.

TÓM TẮT

Mục tiêu:  Đánh giá được tác dụng điều chỉnh rối loạn chuyển hóa lipid máu trên thực nghiệm mô hình Ngoại sinh và ảnh hưởng của Cao lỏng HSN lên hoạt độ enzym AST, ALT trong máu chuột. Phương pháp nghiên cứu: Gây mô hình RLLPM trên chuột cống trắng chủng Wistar lông trắng, cân nặng 200 ± 20g bằng hỗn hợp dầu cholesterol 1ml/100g, được chia thành 5 lô, mỗi lô 10 con và uống thuốc thử tương ứng theo từng lô. Tiến hành cân kiểm tra trọng lượng chuột ở tất cả các lô tại thời điểm trước và hàng tuần của thí nghiệm. Vào ngày đầu tiên, ngày thứ 15 (sau 2 tuần) và ngày thứ 29 (sau 4 tuần) của thí nghiệm, chuột trong các lô cho nhịn ăn qua đêm. Kết quả:Trên mô hình gây tăng lipid máu ngoại sinh ở chuột cống trắng:Cao lỏng HSN ở liều tương đương lâm sàng làm giảm rõ rệt nồng độ triglycerid so với lô mô hình, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,01). Không  làm giảm nồng độ TC và LDL-C (p>0,05).Cao lỏng HSN ở liều cao gấp 3 lâm sàng làm giảm rõ rệt nồng độ triglycerid,  làm tăng rõ rệt nồng độ HDL-C so với lô mô hình (p<0,05), không làm giảm nồng độ TC và LDL-C (p>0,05) và cao lỏng HSN ở cả 2 liều không làm tăng hoạt độ enzym gan AST và ALT trong máu chuột sau khi uống liên tục 4 tuần.

Từ khóa: Rối loạn chuyển hóa Lipid, bài thuốc HSN, tác dụng dược lý trên thực nghiệm, mô hình ngoại sinh.

Chịu trách nhiệm chính:Trần Thị Hồng Ngãi

Ngày nhận bài: 01/4/2019

Ngày phản biện khoa học: 16/4/2019

Ngày duyệt bài: 30/4/2019

1.ĐẶT VẤN ĐỀ

Thế kỷ 21 là thế kỷ của các bệnh nội tiết và rối loạn chuyển hóa . Xã hội hiện đại ngày càng phát triển, tỉ lệ mắc các bệnh chuyển hóa ngày càng gia tăng. Rối loạn chuyển hóa lipid là danh từ dùng để miêu tả một hội chứng bệnh mạn tính được đặc trưng bởi sự thay đổi các chỉ số lipid trong máu. Khi hội chứng này xuất hiện đồng nghĩa với việc người bệnh phải gánh chịu rất nhiều yếu tố nguy cơ mắc các bệnh lý nguy hiểm như: vữa xơ động mạch, nhồi máu cơ tim…Bài thuốc HSN là một bài thuốc được tạo thành bởi sự phối ngũ của 6 vị thuốc nam có tác dụng trừ thấp, hóa đàm. Bài thuốc đã được các thầy thuốc y học cổ truyền sử dụng trong các trường hợp tăng huyết áp, tăng lipid máu, béo bệu; bước đầu đã đạt được nhiều tác dụng trên lâm sàng. Tuy nhiên, bài thuốc HSN chưa được nghiên cứu đầy đủ về tính an toàn và cơ chế tác dụng của bài thuốc. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu này với hai mục tiêu:

(1) Đánh giá tác dụng điều chỉnh rối loạn chuyển hóa lipid máu của Cao lỏng HSN trên chuột thực nghiệm mô hình ngoại sinh

(2) Đánh giá ảnh hưởng của Cao lỏng HSN lên hoạt độ enzym AST, ALT trong máu chuột.

2. CHẤT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Chất liệu nghiên cứu

Thuốc nghiên cứu

Công thức bài thuốc HSN

Các nguyên liệu trong bài thuốc được dùng dưới dạng nguyên liệu khô và đạt tiêu chuẩn trong Dược điển Việt Nam IV, tiêu chuẩn cơ sở. Bài thuốc được bào chế dưới dạng cao lỏng, 1 thang thuốc HSN= 100g dược liệu= 80ml cao lỏng

*Hóa chất và dụng cụ xét nghiệm

+ Hóa chất phục vụ nghiên cứu

– Cholesterol tinh khiết (Merck – Đức)

– Dầulạc (Công ty TrườngAn – Việt Nam)

– Propylthiouracil viên nén 50mg (Biệt dược Rieserstat^® – Rudolf Lomapharm Lohmann GmbH KG –Đức)

– Acid cholic (Sigma – Singapore)

– Atorvastatin viên nén 10mg (STADA–Việt Nam)

– Kít định lượng các enzym và chất chuyển hóa trong máu: TC, TG, HDL-C, ALT (alanin aminotransferase), AST (aspartat aminotransferase) của hãng Hospitex Diagnostics (Italy) và hãng DIALAB GmbH (Áo).

+ Máy móc phục vụ nghiên cứu

– Máy xét nghiệm sinh hóa bán tự động XC – 55 Chemistry analyzer (Trung Quốc)

– Cân phân tích Nhật

* Địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu tác dụng điều chỉnh RLLPM được tiến hành tại Bộ môn Dược lý – Đại học Y Hà Nội.

Các xét nghiệm sinh hóa định lượng các chất trong các nghiên cứu trên đều được thực hiện tại phòng xét nghiệm, Bộ môn Dược lý – Đại học Y Hà Nội.

2.2. Đối tượng nghiên cứu

Chuột cống trắng chủng Wistar, lông trắng, cân nặng 200 ± 20g, do Trung tâm cung cấp động vật thí nghiệm Đan Phượng – Hà Tây cung cấp.

Động vật được nuôi 7- 10 ngày trước khi nghiên cứu tại phòng thí nghiệm của Bộ môn Dược lý – Trường Đại học Y Hà Nội.

Chuột cống được chia thành 5 lô, mỗi lô 10 con, các lô được uống thuốc trong 4 tuần như sau:

• Lô 1 (lô chứng sinh học): hàng ngày chuột chỉ uống nước cất với cùng thể tích nhóm uống thuốc
• Lô 2 (lô mô hình): hàng ngày chuột được uống hỗn hợp dầu cholesterol 1mL/100g chuột, sauđó 2 giờ cho uống nước cất 1mL/100g chuột
• Lô 3 (lô uống atorvastatin): hàng ngày chuột được uống hỗn hợp dầu cholesterol 1ml/100g chuột, sau đó 2 giờ uống atorvastatin liều 10 mg/kg.
• Lô 4 (lô uống cao lỏng HSN liều thấp): hàng ngày chuột được uống hỗn hợp dầu cholesterol 1mL/100g chuột, sau đó 2 giờ uống thuốc thử liều 9,6ml cao lỏng/kg/ngày = 12g dược liệu/kg/ngày (liều có tác dụng tương đương liều dùng trên người, tính theo hệ số 6).
• Lô 5 (lô uống cao lỏng HSN liều cao gấp 3 lần): hàng ngày chuột được uống hỗn hợp dầu cholesterol 1mL/100g chuột, sau đó 2 giờ uống thuốc thử liều 28,8mL caolỏng/kg/ngày = 36g dượcliệu/kg/ngày

2.3. Phương pháp nghiên cứu

Chuẩn bị hỗn hợp dầu cholesterol: mỗi lần cân 50g cholesterol. Đun nóng cách thuỷ 200mL dầu lạc, cho cholesterol vào, khuấy đều cho tan hết, để nguội, cho thêm 5g acid cholic và 2,5g propylthiouracil, cuối cùng cho thêm dầu lạc vừa đủ 500mL.

Trong 1mL hỗnhợpdầu cholesterol chứa: 0,1g cholesterol; 0,01g acid cholic và 0,005g propylthiouracil.

Tiến hành cân kiểm tra trọng lượng chuột ở tất cả các lô tại thời điểm trước và hàng tuần của thí nghiệm. Vào ngày đầu tiên, ngày thứ 15 (sau 2 tuần) và ngày thứ 29 (sau 4 tuần) của thí nghiệm, chuột trong các lô cho nhịn ăn qua đêm.

Lấy 1ml máu đuôi chuột vào buổi sáng hôm sau và tiến hành định lượng Cholesterol, Triglycerid, HDL-C, LDL-C. Trong đó LDL-C được tính theo công thức Friedewald: LDL-C = TC – (HDL-C) – (TG/2,2) (mmol/L). Nghiên cứu được tiến hành tại Bộ môn Dược lý Trường Đại học Y Hà Nội.

2.4. Xử lý số liệu

Số liệu được nhập và xử lý bằng phương pháp và thuật toán thống kê y sinh học trên phần mềm Microsoft Office Excel. Số liệu được biểu diễn dưới dạng ± SD. Kiểm định các giá trị bằng t-test Student hoặc test trước-sau (Avant – Après). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p ≤ 0,05.

Chú thích: Sự khác biệt với lô chứng sinh học với p ≤ 0,05, p ≤ 0,01, p ≤ 0,001 lần lượt được ký hiệu là *, **, **. Và sự khác biệt so với lô mô hình với p ≤ 0,05, p ≤ 0,01, p ≤ 0,001 lần lượt được ký hiệu là +, ++, +++.

3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Biểu đồ 3.1 cho thấy: chuột ở các lô đều có sự gia tăng trọng lượng theo thời gian. Lô mô hình có xu hướng tăng trọng lượng cơ thể ít hơn lô chứng sinh học, tuy nhiên sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Cáclôuốngthuốc atorvastatin 10 mg/kg, cao lỏng HSN liều thấp và liều cao đều có sự tăng trọng lượng theo thời gian nhưng không có sự khác biệt với lô mô hình. 

Bảng 3.1.Mô hình RLLPM bằng hỗn hợp dầu cholesterol

Kết quả bảng 3.1 cho thấy: sau 4 tuần uống hỗn hợp dầu cholesterol đã gây được tình trạng RLLPM trên chuột cống trắng, thể hiện ở mức tăng rõ rệt nồng độ TC, HDL-C, LDL-C bắt đầu xuất hiện sau 2 tuần nghiên cứu.

Kết quả ở biểu đồ 3.2 cho thấy: sau 2 tuần uống hỗn hợp dầu cholesterol để gây RLLPM trên chuột cống trắng: Nồng độ TG ở các lô uống atorvastatin và cao lỏng HSN chưa có sự thay đổi có ý nghĩa thống kê so với lô mô hình (p > 0,05)Atorvastatin 10 mg/kg làm giảm rõ rệt nồng độ TC, LDL-C so với lô mô hình với p ≤ 0,05.HSN liều thấp và liều cao đều không làm thay đổi nồng độ LDL-Ccó ý nghĩa thống kê so với lô mô hình (p > 0,05).

Biểu đồ 3.3.Tác dụng của cao lỏng HSN lênnồng độ lipid máu ở mô hình ngoại sinh sau 4 tuần

Từ số liệu ở biểu đồ 3.3 cho thấy: sau 4 tuần uống hỗn hợp dầu cholesterol để gây RLLPM trên chuột cống trắng:Atorvastatin 10 mg/kg làm giảm rõ rệt nồng độ TC và LDL-C so với lô mô hình (p ≤ 0,05); Cao lỏng HSN ở cả 2 liều đều làm giảm rõ rệt nồng độ TG so với lô mô hình, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,01); Cao lỏng HSNở cả 2 liều đều có xu hướng làm giảm nồng độ TC và LDL-C so với lô mô hình, tuy nhiên sự khác biệt chưa có ý nghĩa thống kêvới p>0,05; Cao lỏng HSN liều cao làm tăng có ý nghĩa thống kê nồng độ HDL-C so với lô mô hình (p<0,001).

Bảng 3.2. Sự thay đổi hoạt độ AST sau 4 tuần uống thuốc

Từ bảng 3.2: Hoạt độ AST ở các lô uống cao lỏng HSN 2 liều không có sự khác biệt so với lô chứng sinh học và khi so sánh 2 thời điểm trước và sau khi uống thuốc thử (p>0,05).

Bảng 3.3. Sự thay đổi hoạt độ ALT sau 4 tuần uống thuốc

Kết quả bảng 3.3 cho thấy: sau 4 tuần nghiên cứu Atorvastatin 10 mg/kg làm tăng rõ rệt hoạt độ ALT so với lô chứng sinh học và lô mô hình, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p<0,05; Cao lỏng HSN không làm tăng rõ rệt hoạt độ ALT so với lô chứng sinh học và lô mô hình, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với p>0,05.

4. BÀN LUẬN

Sau 4 tuần uống hỗn hợp dầu Cholesterol đã gây được tình trạng RLLPM trên chuột cống trắng, thể hiện ở mức tăng rõ rệt nồng độ TC, HDL-C, LDL-C bắt đầu xuất hiện sau 2 tuần nghiên cứu. Trong đó, nồng độ TC tăng 81% sau 2 tuần dùng thuốc và tăng 129% sau 4 tuần dùng thuốc, đặc biệt là LDL-C tăng 299% sau 2 tuầndùngthuốcvà>400% sau 4 tuầndùngthuốc. Sự khác biệt làcó ý nghĩa thống kê với cả 3 chỉ số (p<0.001). Tuy nhiên thì không có sự thay đổi nồng độ TG sau 4 tuần điều trị so với trước khi nghiên cứu và so với lô chứng sinh học (p>0.05).

Theo kết quả nghiên cứu tác dụng điều chỉnh RLLPM của cao lỏng HSN trên mô hình gây RLLPM nội sinh cho thấy, cao lỏng HSN ở liều thấp (liều có tác dụng tương đương liều dùng trên người) và cao lỏng HSN ở liều cao (gấp 3 lần) thì có tác dụng điều chỉnh rối loạn chuyển hóa lipid máu có tính chất chọn lọc trên mô hình nội sinh. Cụthể, caolỏng HSN làm giảm nồng độ Cholesterol toàn phần, Triglycerid,LDL-C và làm tăng chỉ số HDL-C trong đó TC giảm 17.95% ở nhóm dùng cao lỏng HSN liều thấp và 18.46% ở nhóm dùng caolỏng HSN liều cao.

Qua đó, chúng tôi đã dùng 2 liều: 9,6ml cao lỏng/kg/ngày = 12g dược liệu/kg/ngày (liều có tác dụng tương đương liều dùng trên người, tính theo hệ số 6) và liều 28.8ml cao lỏng/kg/ngày = 36g dược liệu/kg/ngàytrong 4 tuần liên tiếp để đánh giá tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu trên mô hình ngoại sinh của cao lỏng HSN và so sánh với nhóm sử dụng liều Atorvastatin 10mg/kg/ngày trên chuột cống trắng chủng Wistar, lông trắng, cân nặng 200 ± 20g.

Đây là nhóm thuốc được nhiều nhà nghiên cứu trong nước và quốc tế sử dụng làm thuốc chuẩn để so sánh.

Theo biểu đồ 3.2 và 3.3 cho thấy, sau 2 tuần nghiên cứu nồng độ TG ở các lô uống Atorvastatin và cao lỏng HSN chưa có sự thay đổi có ý nghĩa thống kê với lô mô hình (p>0.05).

Tuy nhiên, sau 4 tuần điều trị thì cao lỏng HSN ở cả 2 liều đều làm giảm rõ rệt nồng độ TG so với lô mô hình và sự khác biệt là có ý nghĩa thống kê (p<0.01). Đối với các chỉ số TC và LDL-C thì sau 4 tuần điều trị, Atorvastatin làm giảm rõ rệt nồng độ TC và LDL-C so với lô mô hình(p<0.05) và cao lỏng HSN ở cả 2 liều đều có xu hướng làm giảm nồng độ TC và LDL-C so với lô mô hình và nhóm dùng cao lỏng HSN liều thấp 9,6ml cao lỏng/kg/ngày = 12g dược liệu/kg/ngày (liều có tác dụng tương đương liều dùng trên người, tính theo hệ số 6) có tác dụng làm giảm TC và LDL-C tốt hơn so với nhóm dùng cao lỏng HSN liều cao. Tuy nhiên, sự khác biệt là chưa có ý nghĩa thống kê với p>0.05.

Dựa trên các phân tích về thành phần hóa học của một số dược liệu thành phần của cao lỏng HSN cùng một số cơ chế hạ lipid máu, chúng tôi có thể giải thích phần nào tác dụng điều chỉnh RLLPM của thuốc.

Đầu tiên kể đến là thành phần acid Oleanolic và acid ursonic có trong Sơn tra có tác dụng làm giảm nồng độ VLDL và LDL Cholesterol bằng cách ức chế enzyme acyl Co-Acholesretol acyl-tranferase tại ruột (ACAT, enzyme có mặt trong quá trình chuyển hóa mevalonata để tổng hợp cholesterol). Chúng tôi còn nhận thấy thành phần thành phần quercetin có trong Lá sen và Sơn tra có khả năng ức chế tổng hợp Cholesterol nội bào có thể do tác dụng ức chế hoạt động của HMG-CoA reductase. Ngoài ra, hiệu quả bài thuốc trong điều chỉnh RLLPM còn được bổ sung bởi các vị thuốc Cam thảo đất, Trần bì đều chứa phần lớn thành phần flavonoid – 1 chất có tác dụng chống oxy hóa, làm giảm LDL-C bị oxy hóa qua đó làm giảm LDL-C trong cơ thể góp phần làm giảm lipid máu. Ngoài ra, 4 tuần nghiên cứu, nhóm cao lỏng HSN và atorvastatin 10mg/kg/ngày đều không làm thay đổi nồng độ AST. Tuy nhiên, nhóm cao lỏng HSN liều thấp lại có xu hướng làm giảm nồng độ ALT sau 4 tuần điều trị. Tuy nhiên, sự thay đổi là không có ý nghĩa thống kê với p > 0.05. Ở nhóm Atorvastatin 10mg/kg/ngày làm tăng rõ rệt nồng độ ALT so với lô chứng sinh học và lô mô hình, sự khác biệt là có ý nghĩa thống kê với p < 0.05. Như vậy, cao lỏng HSN ở cả 2 liều đều không làm tăng hoạt độ enzym gan AST, ALT trong máu chuột sau khi uống liên tục 4 tuần.

5. KẾT LUẬN

Trên mô hình gây tăng lipid máu ngoại sinh ở chuột cống trắng:

Cao lỏng HSN ở liều tương đương lâm sàng làm giảm rõ rệt nồng độ triglycerid so với lô mô hình, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,01). Không  làm giảm nồng độ TC và LDL-C (p>0,05).

Cao lỏng HSN ở liều cao gấp 3 lâm sàng làm giảm rõ rệt nồng độ triglycerid,  làm tăng rõ rệt nồng độ HDL-C so với lô mô hình (p<0,05), Không làm giảm nồng độ TC và LDL-C (p>0,05).

Cao lỏng HSN ở cả 2 liều không làm tăng hoạt độ enzym gan AST và ALT trong máu chuột sau khi uống liên tục 4 tuần.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Nguyễn Trọng Thông (2011), Thuốc điều trị rối loạn lipoprotein máu, Dược lý học, tập 2, Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam, Hà Nội,:176-185.
2. Seidl PR(2002), Pharmaceuticals from natural products: current trends”, Aninals of the Brazilian Academy of Sciences, 74(1):145-150.
3. Millar JS, Cromley DA, McCoy MG(2005),Determining hepatic triglyceride production in mice: comparison of poloxamer 407 with Triton WR-1339, Journal of Lipid Research, 46: 2023-2028
4. Friedewald WT, Levy RI, Fredrickson DS(1972), Estimation of the Concentration of Low-Density Lipoprotein Cholesterol in Plasma,Without Use of the Preparative Ultracentrifuge, Clinical Chemistry, 18(6): 499-502
5. National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel (2002), Third report of the National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III) final report, Circulation, 106(25): 3143-3421
6. Johnston TP, Palmer WK (1993), Mechanism of poloxamer 407-induced hypertriglyceridemia in the rat, BiochemPharmacol, 46(6): 1037-1042
7. Johnston TP, Nguyen LB, Chu WA et al (2001), Potency of select statin drugs in a new mouse model of hyperlipidemia and atherosclerosis, International Journal of Pharmaceutics, 229(1-2): 75-86
8. Leon C, Wasan KM, Sachs-Barrable K, Johnston TP (2006), Acute P-407 administration to mice causes hypercholesterolemia by inducing cholesterolgenesis and down-regulating low-density lipoprotein receptor expression, Pharm Res, 23(7): 1597-607
9. Li H, Dong B, Park SW et al(2009), Hepatocyte nuclear factor 1α plays a critical role in PCSK9 gene transcription and regulation by the natural hypocholesterolemic compound berberine, J Biol Chem, 284(42): 28885-28895
10. Cao Y, Bei W, Hu Y et al (2012), Hypocholesterolemia of RhizomaCoptidis alkaloids is related to the bile acid by up-regulated CYP7A1 in hyperlipidemic rats, Phytomedicine, 19(8-9): 686-692
11. Dan H, Wu J, Peng M et al (2011), Hypolipidemic effects of Alismatis rhizome on lipid profile in mice fed high-fat diet, Saudi Med J, 32(7): 701-707